可定量觀察活細(xì)胞的膜相態(tài)！

LipiORDER ＜Membrane Lipid Order Imaging Dye＞

LipiORDER是環(huán)境響應(yīng)型的熒光色素，可通過(guò)成像生物膜的相態(tài) (Lipid order）Lo/Ld實(shí)現(xiàn)定量觀察。即使在活細(xì)胞中也顯示高度化學(xué)穩(wěn)定性，且可觀察到各種膜結(jié)構(gòu)的相態(tài)，如細(xì)胞膜、細(xì)胞內(nèi)膜等。

※ 本產(chǎn)品由funakoshi 株式會(huì)社基于高知大學(xué)教育研究部綜合科復(fù)合領(lǐng)域科學(xué)部門 仁子陽(yáng)輔博士的研究成果商品化并銷售。

※ 本產(chǎn)品僅供研究，研究以外不可使用。

LipiORDER成像和神經(jīng)細(xì)胞染色示例

依賴生物膜相態(tài)的本試劑的熒光特性變化（左）和神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)突起部位的染色案例（右）

◆生物膜相態(tài)(Lipid order)是什么？

構(gòu)成生物膜的脂質(zhì)種類繁多，膜的狀態(tài)因其脂質(zhì)組成而大不同。例如，僅由飽和脂肪酸構(gòu)成的脂質(zhì)膜因密度高且包裹堅(jiān)固的特點(diǎn)，被稱為有序相（Lo）；由含有不飽和脂肪酸脂質(zhì)構(gòu)成的脂質(zhì)膜因密度低，被稱為無(wú)序相（Ld）。像這樣的脂質(zhì)微環(huán)境被稱為相態(tài)（Lipid order)。在簡(jiǎn)單模型中，Lo和Ld分離并發(fā)生明確的相分離（如圖），但由于細(xì)胞生物膜中的脂質(zhì)種類繁多，不會(huì)發(fā)生圖中模型所示的簡(jiǎn)單相分離，而是反映總和性質(zhì)的相態(tài)。

另外，膜蛋白的存在也被認(rèn)為會(huì)影響相態(tài)，而實(shí)際細(xì)胞膜上的相態(tài)更為復(fù)雜。細(xì)胞膜上的Lo有時(shí)也被稱為脂筏（Lipid raft），作為生物膜的功能域備受關(guān)注。這種脂質(zhì)膜相態(tài)的觀察對(duì)于理解膜的生物物理學(xué)性質(zhì)（如生物膜的流動(dòng)性和硬度等）非常重要，期待未來(lái)能開(kāi)發(fā)出針對(duì)它的分析方法。

脂質(zhì)膜的相態(tài)成像

近年，Laurdan、di-4-ANEPPDHQ、Nile Red等響應(yīng)分子極性并發(fā)生色調(diào)變化的熒光色素（solvatochomic dye) 已被應(yīng)用于生物膜的相態(tài)可視化。由于這些分子極性響應(yīng)型熒光色素會(huì)根據(jù)相態(tài)改變熒光波長(zhǎng)，通過(guò)檢測(cè)特定激發(fā)光中的兩種波長(zhǎng)的熒光獲得其熒光強(qiáng)度比，可半定量分析相態(tài)。（詳細(xì)信息，請(qǐng)參閱下述的“原理"）。

然而，這些試劑在實(shí)際使用中還存在如細(xì)胞內(nèi)局部不均勻、對(duì)光不穩(wěn)定等問(wèn)題，。本產(chǎn)品LipiORDER利用高知大學(xué)的仁子陽(yáng)輔博士和Strasbourg大學(xué)的Andrey Kylmchenko博士的團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的新型芘衍生物熒光探針（原著論文名PK），以及在Lo、Ld上熒光特性不同的特征，可定量分析生物膜相態(tài)。與Laurdan相比，顯示很高的光穩(wěn)定性，在活細(xì)胞中也能維持化學(xué)穩(wěn)定性，因此活細(xì)胞成像優(yōu)異。

參考：膜的相態(tài)成像應(yīng)用實(shí)例

相態(tài)被認(rèn)為是決定脂質(zhì)膜流動(dòng)性的參數(shù)，以Laurdan為首，相態(tài)成像被用于各種生命現(xiàn)象的分析。Laurdan會(huì)根據(jù)相態(tài)將熒光波長(zhǎng)由藍(lán)色（Lo）變?yōu)榫G色（Ld），觀察藍(lán)色和綠色兩種波長(zhǎng)的熒光，其熒光強(qiáng)度比（綠色熒光強(qiáng)度/藍(lán)色熒光強(qiáng)度）和GP值（generalized polarization；(F_blue-F_green/F_blue F_green）的計(jì)算值可用于評(píng)價(jià)相態(tài)。例如進(jìn)行外部刺激（藥物處理、氧化應(yīng)激等）、基因操作（目的基因的過(guò)表達(dá)或敲降）引起的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化及其相態(tài)的分析。此外，作為細(xì)胞功能分析的一環(huán)，還觀察到了細(xì)胞類型間的相態(tài)比較。

Laurdan：在觀察到兩種波長(zhǎng)的熒光后，從觀察圖像中計(jì)算出熒光比（或GP值），使用擬色進(jìn)行比率型圖像分析。

◆原理

LipiORDER是根據(jù)溶劑的分子極性改變熒光特性的溶劑極性響應(yīng)型熒光色素（Solvatochromic fluorescent dye)（圖1）。此外，本試劑對(duì)脂質(zhì)膜具有高親和性，濃縮在細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)中。通過(guò)這兩個(gè)特點(diǎn)，本試劑根據(jù)膜內(nèi)部的極性將熒光由綠色變?yōu)榧t色。相態(tài)反映了脂質(zhì)的包裹密度，稀疏包裹的Ld極性高，而緊密包裹的Lo極性低，通過(guò)觀察膜結(jié)構(gòu)的極性可定量觀察相態(tài)（圖2上）。實(shí)際上，與模型Lo相（sphingomyelin/Cholesterol; SM/Chol）顯示綠色熒光（熒光波長(zhǎng)最大~510 nm）相對(duì)，模型Ld相（dioleylphosphatidylcholine；DOPC）發(fā)生長(zhǎng)波長(zhǎng)偏移，顯示紅色熒光（熒光波長(zhǎng)最大~575 nm）（圖2下）。另外，在被認(rèn)為是SM/Chol與DOPC中間模型的DOPC/Chol中，觀察到SM/Chol與DOPC中間的熒光光譜，可通過(guò)觀察本試劑獲得的綠色熒光強(qiáng)度F_G（熒光顯微鏡中的檢測(cè)波長(zhǎng)范圍約為500~550 nm）和紅色熒光強(qiáng)度F_R（檢測(cè)波長(zhǎng)范圍約550~650 nm）的熒光強(qiáng)度比F_R/F_G，相對(duì)定量膜相態(tài)。

圖1. 溶劑的分子極性依賴性熒光響應(yīng)性

圖2. 溶劑的分子極性依賴性熒光響應(yīng)性

上圖：根據(jù)相態(tài)的熒光特征變化圖  下圖：模型脂質(zhì)體中的熒光光譜

◆特點(diǎn)

●　由405 nm激發(fā)產(chǎn)生的綠色熒光強(qiáng)度F_G（500~550nm）和紅色熒光強(qiáng)度F_R（550~650nm）的熒光強(qiáng)度比F_R/F_G和相態(tài)之間存在相關(guān)性。

●　※ 本試劑幾乎不被488 nm激光吸收，可作為激發(fā)488 nm以上的光的熒光色素使用。

●　顯示出的性質(zhì)：熒光比F_R/F_G的值越大，則越接近無(wú)序相Ld狀態(tài)；F_R/F_G值越小，則越接近有序相Lo狀態(tài)。

●　極性響應(yīng)型熒光色素，在低極性環(huán)境中發(fā)出熒光。在水溶液中不發(fā)出熒光，在高S/N比下可觀察到膜結(jié)構(gòu)和脂肪滴。

●　只需將本試劑添加至活細(xì)胞中，即可攝入至細(xì)胞膜、內(nèi)膜和脂肪滴，并會(huì)根據(jù)膜的相態(tài)表現(xiàn)出不同的熒光特性。

●　擁有脂質(zhì)體模型、培養(yǎng)細(xì)胞和斑馬魚的染色實(shí)績(jī)。

●　※ 有關(guān)斑馬魚的染色情況，請(qǐng)參考原著論文。

●　已確認(rèn)本試劑的熒光特性幾乎不受蛋白、多糖等的影響。

●　與現(xiàn)有的分子極性響應(yīng)型熒光色素Laurdan相比，顯示更高的光穩(wěn)定性。

◆原著論文

Valanciunaite et al., Anal. Chem., 92, 6512-6520 (2020)　Polarity Mapping of Cells and Embryos by Improved Fluorescent Solvatochromic Pyrene Probe.

◆觀察注意事項(xiàng)

生物膜相態(tài)是通過(guò)熒光比來(lái)定量的，所以需要檢測(cè)在405 nm激發(fā)下的兩種波長(zhǎng)的熒光。同時(shí)在Green頻道約500-550 nm和Red頻道約550-650 nm獲得熒光，再使用各種分析軟件算出熒光比。為獲取熒光比，在每次熒光觀察時(shí)需注意不能使信號(hào)飽和。這種色素在488 nm、560 nm處不吸收，所以可與一般的綠色、紅色和近紅外熒光發(fā)生共染色。建議獲取以下溶液的熒光圖像作為校準(zhǔn)對(duì)照：

◆應(yīng)用數(shù)據(jù)

■　活細(xì)胞成像

添加LipiORDER（300 nM in HBSS）至COS7細(xì)胞中，培養(yǎng)10 min后用激光共聚焦顯微鏡獲取兩種波長(zhǎng)的熒光圖像（激發(fā)光：405 nm；熒光Green：470-550 nm，Red：550 nm~）。通過(guò)ImageJ對(duì)綠色熒光圖像和紅色熒光圖像進(jìn)行比率測(cè)量分析（熒光比F_R/F_G），并用假色（Lo■■■■■■■Ld）可視化相態(tài)。細(xì)胞膜的F_R/F_G低，估計(jì)在ER等細(xì)胞內(nèi)膜中F_R/F_G高。

Heat map的詳細(xì)分析結(jié)果。

將比率測(cè)量分析圖像的各個(gè)熱圖層抽出，并分析。

■　觀察神經(jīng)細(xì)胞膜的相結(jié)構(gòu)

添加LipiORDER（300 nM in HBSS）至E17.5小鼠來(lái)源的海馬原代神經(jīng)細(xì)胞（DIV3或DIV12）中，培養(yǎng)10 min后用激光共聚焦顯微鏡獲取兩種波長(zhǎng)的熒光成像（激發(fā)光：405 nm、熒光Green：470~550 nm，Red：550 nm~）。通過(guò)ImageJ對(duì)綠色熒光圖像和紅色熒光圖像進(jìn)行分析（熒光比F_R/F_G），并用假色（Lo■■■■■■■Ld）可視化相態(tài)。通過(guò)比率測(cè)量分析，可觀察到在所有膜結(jié)構(gòu)中，細(xì)胞膜的F_R/F_G低，與Lo的環(huán)境接近；內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的F_R/F_G高，與Ld的環(huán)境接近。

各個(gè)圖像的熒光觀察圖像以及比例分析的應(yīng)用。

在激光共聚焦顯微鏡的405 nm激發(fā)光下，使用綠色熒光圖像（470-550 nm）和紅色熒光圖像（550 nm以上），并通過(guò)ImageJ算出比率測(cè)量分析圖像。

將比率測(cè)量分析圖像的疑似色熱圖階段性分割，可以看出，F_R/F_G（接近Lo）的信號(hào)，隨著熒光比率不斷增大（接近Ld），會(huì)距離細(xì)胞膜越來(lái)越遠(yuǎn)。

■　觀察依賴于細(xì)胞外刺激的膜相態(tài)變化

用膽guchun去除劑的β-cyclodextrin（β-CD; 15 mM）處理COS7細(xì)胞4 h，清洗細(xì)胞，并添加LipiORDER（300 nM in HBSS），培養(yǎng)細(xì)胞10 min后用激光共聚焦顯微鏡獲取兩種波長(zhǎng)的熒光圖像（激發(fā)光：405nm，熒光Green：470-550nm，Red：550nm~）。通過(guò)ImageJ對(duì)綠色熒光圖像和紅色熒光圖像進(jìn)行比率測(cè)量分析（熒光比F_R/F_G），并用擬色（Lo■■■■■■■Ld）可視化相態(tài)。通過(guò)β-CD處理可觀察到細(xì)胞結(jié)構(gòu)的顯著變化，提取熱圖的深綠色層（熒光比0.06-0.34）時(shí)，發(fā)現(xiàn)其分布發(fā)生了很大的變化。

※ 上述細(xì)胞染色數(shù)據(jù)，由名古屋市立大學(xué)大學(xué)院 藥學(xué)研究科 服部光治教授提供。

■　光穩(wěn)定性

比較現(xiàn)有的分子極性檢測(cè)試劑Laurdan和LipiORDER的光穩(wěn)定性。與Laurdan表現(xiàn)出顯著的光衰減相比，LipiORDER即使在暴露1 h后仍保持穩(wěn)定。該試劑也可用于長(zhǎng)期成像。

※ 本頁(yè)面產(chǎn)品僅供研究用，研究以外不可使用。