簡要描述：DNs-Rh是可以在活細胞中觀察Glutathione S-transferase（GST）酶活性的熒光探針。由于可以根據(jù)GST活性發(fā)出綠色熒光，可用于評價細胞內(nèi)GST的活性。GST亞家族跨度廣泛，可以實現(xiàn)總GST活性的可視化。
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可用于活細胞的GST活性檢測探針
DNs-Rh ＜Cell-based GST Activity Assay Reagent＞
DNs-Rh是可以在活細胞中觀察Glutathione S-transferase（GST）酶活性的熒光探針。由于可以根據(jù)GST活性發(fā)出綠色熒光，可用于評價細胞內(nèi)GST的活性。GST亞家族跨度廣泛，可以實現(xiàn)總GST活性的可視化。
※本產(chǎn)品基于名古屋大學 理學研究科 阿部洋教授的研究成果商品化。
※本產(chǎn)品僅供科研，嚴禁用于科研以外用途。
DNs-Rh具有細胞膜透過性，隨著細胞內(nèi)GST酶活性改變而產(chǎn)生綠色熒光。通過顯微鏡或流式細胞儀定量熒光強度，從而實現(xiàn)GST活性的相對定量。
◆GST及其活性檢測方法
Gluthathione S-Transferase（GST）家族廣泛存在于細菌及動植物中，細胞內(nèi)的疏水性外源物質(zhì)（xenobiotics）被添加到gluthathione（GSH）中，具有轉(zhuǎn)換為GSH綴合物（GSH-conjugate）的活性。GSH綴合物通過MRP（multidrug resistance-associated protein）運輸積極地排出細胞外，存在去除異物的機制。因此，GST可以作為排出具有潛在細胞毒性的外源性物質(zhì)的解毒因子而發(fā)揮作用。
另一方面，由于大多數(shù)的抗癌劑等醫(yī)藥品也是通過GST轉(zhuǎn)換為GSH綴合物排出細胞外，GST作為耐藥因子具有削弱藥效的負面效果。尤其是隨著癌癥的惡化特定的GST同種型（GSTP1）的表達量增強，癌細胞獲得了強耐藥性。
GST既是異物代謝和解毒作用因子，也具有耐藥性因子的作用。因此，需要合適的檢測細胞內(nèi)GST活性的技術，但傳統(tǒng)方法僅限于in vitro 的活性檢測，缺少在活細胞內(nèi)觀察活性的方法。
名古屋大學阿部洋教授及其研究人員們開發(fā)的DNs-Rh是細胞膜透過性的化合物，是一種可以根據(jù)GST酶活性產(chǎn)生綠色熒光的GST活性應答探針。因為可以用于活細胞，進行各類細胞的GST活性的定量化和刺激依賴性的GST活性的監(jiān)測，可以用于傳統(tǒng)方法無法實現(xiàn)的基于細胞水平的抑制劑的開發(fā)等的各種應用。
GST作用示意圖
GST活性檢測用探針的比較
探針名稱 | 傳統(tǒng)方法（CDNB） | DNs-Rh | ||
檢測方法 | UV（~340 nm） | 綠色熒光（Ex / Em = 496 / 520 nm） | ||
檢測對象 | 廣泛的GST家族 | 廣泛的GST家族 | ||
適用實驗 | in vitro（如裂解液或純化酶） | 可以 | 可以 | |
活細胞實驗 | 成像 | 不可以 | 可以 | |
流式細胞術 | 不可以 | 可以 | ||
檢測靈敏度 | 低（UV測定） | 高（熒光測定） | ||
高通量和簡便性 | 低（需要配制裂解液） | 高（活細胞狀態(tài)下觀察） | ||
非特異性反應（GST非依賴的GSH反應性） | 高 | 低 | ||
與其他的因子同時檢測 | 不可以 | 可以（可以和藍色和紅色熒光同時使用） | ||
◆詳細原理
DNs-Rh是在Rhodamine110上添加2個GST基質(zhì)2,4- dinitrobenzene sulfonamide（DNB）的化合物，呈消光狀態(tài)。DNB基質(zhì)通過GST轉(zhuǎn)換為GSH綴合體，Rhodamine 110釋放出來并發(fā)出綠色熒光（激發(fā)／熒光 = 496 / 520 nm）。DNs-Rh最初開發(fā)作為檢測體內(nèi)硫醇的試劑1），但后來卻被發(fā)現(xiàn)其也能高效用作GST活性的檢測試劑2）。與硫醇應答相比，GST應答性更強，現(xiàn)在我們期待DNs-Rh能成為活細胞用的GST活性檢測探針4）。
原理示意圖
◆參考文獻
1. | Shibata, A.,et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 18, 2246-2249 (2008) [PMID:18358719] "Rhodamine-based fluorogenic probe for imaging biological thiol." |
2. | Alander, J., et al., Anal. Biochem., 390, 52-56 (2009) [PMID:19348782] "Characterization of a new fluorogenic substrate for microsomal glutathione transferase 1." |
3. | Zhang, J.,et al., J. Am. Chem. Soc., 133, 14109-14119 (2011) [PMID:21786801] "Synthesis and characterization of a series of highly fluorogenic substrates for glutathione transferases, a general stategy." |
4. | Shishido, Y., et al.,ChemBioChem., (in press) "A covalent inhibitor for Glutathione S-Transferase Pi (GSTP1-1) in human cells." |
◆特點
● 根據(jù)GST活性釋放rhodamine110產(chǎn)生綠色熒光（激發(fā)/熒光=496/520 nm）。
● 具有細胞膜通透性，只需添加至培養(yǎng)基即可使用。
● 已確認與各種GST家族具有交叉反應性
◆應用實例
熒光光譜（反應前后）
向GSTP1重組體（10 μg/mL）中添加DNs-Rh（1 μM）、GSH（1 mM）30分鐘后，測定激發(fā)光為490 nm時的熒光光譜。僅在GSH / GSTP1存在時觀察到了Emmax 520 nm附近的熒光。
熒光光譜
GST in vitro活性檢測
向GSTP1重組體（10 μg/mL）中添加DNs-Rh（1 μM）、GSH（1 mM）觀察綠色熒光強度（Ex / Em 490 / 520 nm）隨時間的變化，縱軸將1 μM Rhodamine 110溶液的熒光強度設為100%。GST存在時，可以發(fā)現(xiàn)（GSH（＋）/ GST（＋））在約30分鐘左右的時候熒光強度明顯增強，約55%的探針轉(zhuǎn)換成Rhodamine，相對的，在GSH（＋）/ GST（?）的條件下，可以觀察到GSH稍微有所增加，但是Rhodamine的轉(zhuǎn)換率只有3%。
※ 正如原理所述，DNs-Rh與硫醇化合物反應甚微。與GST存在時相比反應明顯較弱，但是也有可能經(jīng)過幾個小時的長時間反應使熒光強度增強，因此建議在反應30~60分
※ 鐘左右后即刻進行觀察。
活細胞熒光測定
培養(yǎng)細胞中的GST活性測定
向HeLa細胞中添加2.5 μM的DNs-Rh，孵育30分鐘后用熒光顯微鏡（Ex 480 / Em 535 nm）進行觀察。添加1 mM的不可逆性抑制物質(zhì)CNBSF（#FDV-0031）作為前處理，反應15分鐘。通過DNs-Rh 從細胞內(nèi)觀察到 Rhodamine 110 的綠色熒光，但是用抑制物質(zhì) CNBSF 進行前處理時，熒光強度明顯減弱。
※ 成像注意：本試劑是通過觀察GST釋放出來的rhodamine 110在細胞內(nèi)的分布，雖然可以基于熒光強度觀察GST的相對活性強度，但不能實現(xiàn)細胞內(nèi)GST定位的可視化。
培養(yǎng)細胞熒光成像
流式細胞術定量GST活性
左：向K562細胞中添加2.5 μM的DNs-Rh，5、60、180分鐘后用流式細胞儀檢測（Ex / Em = 488 / 525 nm）。
左：可以觀察到熒光強度隨時間變化增強。
右：向K562細胞和HL60細胞中添加2.5 μM的DNs-Rh，60分鐘后用流式細胞儀檢測（Ex / Em = 488 / 525 nm）。
右：與K562細胞相比，每個HL60細胞都顯示出更高的GST活性。
流式細胞儀檢測
※ 本頁面產(chǎn)品僅供研究用，研究以外不可使用。
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級 | 備注 |
| FDV-0030 | DNs-Rh ＜Cell-based GST Activity Assay Reagent＞ | 0.1 μmol | - | - |
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