簡要描述：ClearSee™ 是一款植物透明化試劑，僅需固定、洗凈、透明化3步操作即可輕松實現(xiàn)植物組織的透明化。本方法由名古屋大學研究生院的栗原大輔博士等人開發(fā)。
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為植物學研究開辟未來的新型透明化試劑
ClearSee™
ClearSee™ 是一款植物透明化試劑，僅需固定、洗凈、透明化3步操作即可輕松實現(xiàn)植物組織的透明化。本方法由名古屋大學研究生院的栗原大輔博士等人開發(fā)。
作為植物科學的研究工具，ClearSee™ 有望用于闡明細胞水平的現(xiàn)象與生物個體之間的系統(tǒng)聯(lián)系。
<資料提供>
名古屋大學研究生院 理學研究科
特聘助教栗原大輔、先驅(qū)研究員水多陽子
◆特點
● 植物用透明化試劑
● 無需制備切片，即可熒光觀察植物內(nèi)部的整體結構
● 操作僅需3步：①固定、②清洗、③透明化
◆可透明化的組織
植物
◆透明化所需時間
根莖：1~2日、葉和幼苗：4~7日、雌蕊：2周、成熟組織：4周
※ 上述時間僅供參考。透明化所需的時間因植物種類以及組織不同有所差異。
◆透明化所需的試劑
▼試劑
1. ClearSee™
2. 純凈水
3. 多聚甲醛 (產(chǎn)品編號：160-16061)
4. 2 mol/L *溶液（產(chǎn)品編號：194-05361)
5. 10 x PBS (產(chǎn)品編號：163-25265)
6. 1 x PBS (產(chǎn)品編號：164-25511)
7. 亞*（產(chǎn)品編號：198-03412） ※僅在使用ClearSeeAlpha時需要使用
▼儀器
1. 高壓滅菌鍋 2. 局部排氣設備（如通風室） 3. 真空泵 4. 干燥器 5. 60℃恒溫器 6. 錐形管 7. 微管 | 8. 封口膜 9. 針 10. 鑷子 11. 蓋玻片 12. 載玻片 13. 凡士林 14. ClearSee™透明化標本用熒光顯微鏡※和推薦物鏡※※ |
※共焦顯微鏡、雙光子顯微鏡 ※※請準備適配折射率 (RI=1.41)的物鏡，建議在獲取數(shù)據(jù)之前咨詢顯微鏡制造商。 | |
ClearSeeAlpha是什么？
ClearAlpha是改良版的ClearSee™，改良方法為向ClearSee™中加入亞*至50mM。使用常規(guī)款ClearSee™進行透明化時，部分種類植物的葉和果實會因氧化而變成褐色，導致難以觀察，而亞*的還原作用可以實現(xiàn)清晰的觀察。
請根據(jù)需求制備ClearSeeAlpha，即配即用。
◆Protocol
Protocol（視頻）
請查看以下文獻：
Kurihara, D. et al., : J. Vis. Exp., e63428, 179(2022).
doi:10.3791/63428
◆應用示例
擬南芥（葉/根）的觀察示例
圖1. 透明化的擬南芥葉
明亮視野中組織呈透明狀，葉綠素的紅色自發(fā)熒光消失。由于可以觀察完整的葉片，因此也可以觀察到內(nèi)部維管束中的熒光蛋白。
圖2. 使用ClearSee™處理4日的擬南芥根1）
生長素應答細胞的細胞核用綠色顯示，全身細胞的細胞核用紫色顯示。
*由Kurihara, D. et al., : Development, 142(3), 4168-4179 (2015)改編并轉載。
雌蕊的熒光觀察示例
圖3. 觀察完整透明化后的雌蕊2）
花粉管上使用4種熒光蛋白（藍色、綠色、黃色和紅色）分別進行標記。
*由Kurihara, D. et al., : Development, 142(3), 4168-4179 (2015)改編并轉載。
其他植物
圖4. 透明化的植物葉片
使用ClearSee™處理6天的藍豬耳、矮牽牛、煙草、番茄、黃瓜、水稻※的葉片。
※ 對水稻進行透明化處理時，由于水稻葉片表面存在蠟質(zhì)層，溶液難以滲透到組織中。因此在固定操作之前，請將葉片浸泡在氯仿等有機溶劑中10~30 s，以去除蠟質(zhì)。
子房和角果的觀察示例
圖5. 左：ClearSee™、中：ClearSee改良方法（＋50mM 2-氨基乙硫醇鹽酸鹽）、右：ClearSeeAlpha（＋50mM 亞*）
通過向ClearSee™中加入50 mM亞*（即“ClearSeeAlpha"法），可抑制氧化導致的褐色色素沉著。
*由Kurihara, D. et al., : Plant Cell Physiol., 62(8), 1302-1310 (2021)改變并轉載
擬南芥（種子）的觀察示例
對授粉5天后的擬南芥種子進行透明化處理，并用xiang草醛染色單寧。
使用ClearSeeAlpha法的種子在15天后可確認到氧化單寧的去除效果，可對透明化的種子進行觀察。
*由Kurihara, D. et al., : Plant Cell Physiol., 62(8), 1302-1310 (2021)改變并轉載
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| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級 | 備注 |
| 031-25151 | ClearSee™ ClearSee™ 植物透明劑 | 50 mL | 植物透明化用 | - |
| 160-16061 | Paraformaldehyde 多聚甲醛 | 100 g | 組織固定用 | - |
| 162-16065 | Paraformaldehyde 多聚甲醛 | 500 g | 組織固定用 | - |
| 194-05631 | 2mol/L Sodium Hydroxide Solution 2mol/L *溶液 | 100 mL | - | - |
| 196-05635 | 2mol/L Sodium Hydroxide Solution 2mol/L *溶液 | 500 mL | - | - |
| 163-25265 | 10×PBS(-) 10×PBS(-)緩沖液 | 500 mL | - | - |
| 164-25511 | 1×PBS(-) 1×PBS(-)平衡緩沖液 | 5 L | - | - |
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級 | 備注 |
| 198-03417 | Sodium Sulfite 亞* | 20 kg | - | - |
| 198-03412 | Sodium Sulfite 亞* | 25 g | - | - |
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級 | 備注 |
| 035-22991 | Coelenterazine h 腔腸熒光素h | 1 mg | - | - |
| 095-06573 | Isoflurane 異氟醚 | 1 L | - | - |
| 099-06571 | Isoflurane 異氟醚 | 250 mL | - | - |
| 193-17791 | Sevoflurane qi氟烷 | 250 mL | - | - |
| 015-25331 | Atipamezole Hydrochloride 阿替美唑鹽酸鹽； 4-（2-乙基-2-茚滿）咪唑鹽酸鹽 | 10 mg | - | - |
| 011-25333 | Atipamezole Hydrochloride 阿替美唑鹽酸鹽； 4-（2-乙基-2-茚滿）咪唑鹽酸鹽 | 50 mg | - | - |
| 021-19001 | Butorphanol Tartrate 酒石酸bu托啡諾 | 50 mg | - | - |
| 027-19003 | Butorphanol Tartrate 酒石酸bu托啡諾 | 500 mg | - | - |
| 135-13791 | Midazolam 咪唑安定 | 500 mg | - | - |
| 139-17471 | Medetomidine Hydrochloride 鹽酸美托咪啶 | 1 mg | - | - |
| 135-17473 | Medetomidine Hydrochloride 鹽酸美托咪啶 | 10 mg | - | - |
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